Análisis y simulación de la cromatografía frontal de plásmidos en sistemas de membranas

Abstract

Tesis de maestría en ciencias de la ingeniería. En esta investigación se logró preparar y determinar las propiedades básicas de adsorción de columnas de intercambio iónico empacadas con membranas y con adsorbentes macroporosos. Las columnas de membranas mostraron un adecuado comportamiento dinámico y una capacidad de adsorción de plásmidos prácticamente igual a la reportada en literatura, mientras que la de los adsorbentes macroporosos fue menor. Los estudios de equilibrio con el plásmido pCAT mostraron que el modelo de Langmuir se ajustó adecuadamente a los datos experimentales. Se desarrolló y evaluó un nuevo bioproceso para la producción de DNA plasmídico, que comprende las etapas de fermentación, recuperación y purificación del plásmido. La propagación de E. coli., la cepa huésped del plásmido de interés, alcanzó productividades típicas de las operaciones de fermentación batch. La etapa de recuperación, comprende lisis celular, neutralización, clarificación y diafiltración. Mediante el uso de agitación moderada en la lisis y neutralización se logró obtener flóculos de gran dimensión, lo que permitió lograr una adecuada clarificación del lisado mediante una batería de separación sólido-líquido. El lavado y concentrado del caldo clarificado se realizó mediante diafiltración, lo cual permitió su procesamiento posterior. En la purificación del caldo de pRL-CMV con el AMP-II, la capacidad de la columna prácticamente no varió con el flujo de alimentación en el rango estudiado. Mediante la elución con gradiente se logró la concentración del plásmido y una mayor purificación del mismo respecto a la elución isocrática. En los experimentos cromatográficos con membranas de intercambio iónico, se obtuvo un gradiente de elución que permitió una concentración y purificación parcial del plásmido pVR1012-NH36. Mediante una segunda operación cromatográfica de la fracción recuperada, se logró obtener el plásmido con la pureza requerida para RNA, determinada en gel de agarosa al 0.8%. Estos resultados apoyan la factibilidad técnica de un nuevo bioproceso para la producción de plásmidos, mediante el uso de sólo cromatografía de intercambio iónico en membranas e la etapa de purificación. Por medio de simulación se logró escalar al bioproceso desarrollado para la producción de plásmidos (bioproceso base). El análisis económico sugirió realizar modificaciones a este proceso, de tal manera que se generó un bioproceso alternativo. El análisis económico del bioproceso alternativo presentó valores mejorados en los indicadores económicos, sugiriendo que la producción de plásmidos es económicamente viable. Este tipo de análisis tradicionalmente empleado para la evaluación de proyectos, también resulta una herramienta valiosa para fijar directrices de investigación. La investigación muestra que la optimización del vector, el medio de cultivo y el modo de operación del fermentador para alcanzar mayores productividades del plásmido mejorarían aún más la competitividad tecnológica del bioproceso.