Determinación de parámetros cinéticos (KM y Kcat) de tripsina I de sardina monterey (Sardinops sagax caerulea) mediante calorimetría de titulación isotérmica

Abstract

La sardina Monterey (Sardinops sagax caerulea) es uno de los principales productos pesqueros en el estado de Sonora. Sin embargo, año con año se generan grandes cantidades de desechos como las vísceras debido al procesamiento de la sardina. Las vísceras poseen un alto valor agregado ya que son una fuente de enzimas proteasas las cuales pudieran tener numerosas aplicaciones biotecnológicas debido a que presentan una alta eficiencia catalítica (kcat/KM). Dichos parámetros cinéticos se obtienen en base a mediciones de la actividad enzimática determinando la conversión de sustrato a producto a partir, de métodos de detección química o métodos espectrofotométricos. Los métodos mencionados se definen como métodos tradicionales y no son factibles para todas las enzimas debido a la formación de soluciones opacas, los múltiples pasos necesarios en los ensayos discontinuos, entre otras características. Sin embargo, se han desarrollado métodos universales que permiten la obtención de los parámetros cinéticos utilizando herramientas como la calorimetría de titulación isotérmica (CTI). Mediante la técnica CTI se calcula la constante de Michaelis-Menten (KM) y la constante catalítica o de recambio (kcat) a partir del poder térmico generado por la conversión enzimática de sustrato a producto, siendo la velocidad de reacción directamente proporcional al poder térmico generado. Por lo que el objetivo del presente estudio es establecer las condiciones óptimas para la obtención de constantes cinéticas KM y kcat de tripsina I de Sardina Monterey (Sardinops sagax caerulea) mediante calorimetría de titulación isotérmica así como su comparación con el método espectrofotométrico. Para alcanzar dicho objetivo se realizó la purificación de tripsina de sardina Monterey mediante cromatografía de filtración en gel y cromatografía de afinidad a benzamidina obteniendo un rendimiento de 1.1 mg/mL de tripsina 1. El sustrato utilizado para llevar a cabo los ensayos cinéticos fue benzoil-arginina-etil-éster (BAEE). Los valores de los parámetros cinéticos de tripsina I de sardina Monterey mediante CTI a 20°C fueron kcat 14.6 s-1, KM 0.0014 mM, mientras que a 15°C fueron kcat 13.6 s-1, KM 0.004 Mm y a 4°C resultaron kcat 0.454 s-1 y KM 0.00052 mM. Por otra parte se encontró que los valores de los parámetros cinéticos de tripsina I de sardina Monterey por espectrofotometría fueron los siguientes: a 25°C kcat 436.5 s-1, KM 0.0018 mM, a 20°C kcat 409.7 s-1, KM 0.0018 mM, y a 15°C kcat 288 s-1, KM 0.003 mM. Los resultados mostraron que el valor de kcat obtenido a partir del método de calorimetría de titulación isotérmica difiere considerablemente del valor de kcat obtenido por espectrofotometría. Por el contrario, se obtuvo que los valores de KM generados mediante calorimetría de titulación isotérmica de inyección simple son similares a los obtenidos mediante espectrofotometría. Sin embargo, a pesar de las diferencias podemos contemplar que se mantiene el comportamiento de tripsina I como enzima psicrófila, ya que la eficiencia catalítica por ambos métodos es mayor que la de sus homólogos como la tripsina bovina de acuerdo a lo previamente publicado por Arvizu y cols. en el 2012; por lo que podemos definir a la calorimetría de titulación isotérmica como un método alternativo para la determinación de parámetros cinéticos no solo de la hidrólisis enzimática llevada a cabo por tripsina, si no para otros procesos enzimáticos.